maanantai 22. kesäkuuta 2015

Uutta tutkimustietoa borreliabakteerin käyttäytymisestä suhteessa eri lääkkeisiin

Lääkäri Daniel A. Jaller kertoo blogissaan Johns Hopkinsissa tehdystä tutkimuksesta, jossa on koeputkiolosuhteissa kartoitettu borreliabakteerin eri muotojen käyttäytymistä suhteessa eri antibiootteihin ja muihin lääkkeisiin. Tutkimuksessa testattiin yhdistelmähoitoa ja todettiin, että kolmen tietyn lääkkeen cocktail onnistui (koeputkiolosuhteissa) tuhoamaan kaikki borreliabakteerin muodot. Tämä yhdistelmä koostui seuraavista lääkkeistä: daptomysiini (hyvin kallis ja rajoitetusti saatavissa oleva lääke), kefoperatsoni (ei ole tällä hetkellä saatavilla) ja doksisykliini. Kaksi näistä lääkkeistä oli bakterisidisiä eli bakteereita tappavia ja yksi lääkkeistä oli bakteriostaattinen eli bakteerien kasvua estävä. Teoriassa tämän tyyppiset lääkkeet voivat tehdä toistensa vaikutukset tyhjiksi, mutta käytännössä tämä ei pidä paikkaansa. Toinen, vielä tuoreempi koeputkitutkimustulos esittää, että borreliabakteerin kaikki muodot voidaan tuhota yhdellä ainoalla, pulssimuotoisena annetulla lääkkeellä, Rocephinillä.

Koeputkitutkimusten tuloksista ei voida suoraan johtaa kliinisen hoitotyön perusteita, mutta tutkimustulokset todistavat, että borreliabakteerit todellakin ovat vaikeasti tuhottavissa olevia ja että IDSA:n hoitolinjaukset (joiden mukaan borreliabakteeri on helposti tuhottavissa kahden viikon doksisykliinikuurilla) ovat täysin riittämättömiä.

Tutkimuksissa kumottiin myös väite siitä, että Flagyl olisi tehokas bakteerin kystisten muotojen tuhoaja, tai että Rifampin yksinään kykenisi tuhoamaan noita muotoja (yhdessä doksisykliinin tai amoksisilliinin kanssa käytettynä Rifampin voi kyllä antaa doksisykliinille ja amoksisilliinille kystisiä muotoja tuhoavia ominaisuuksia).

Kiinnostavaa on myös, että amfoterisiini b, sieni- ja alkueläintauteihin tehoava antimikrobinen lääke, samoin kuin malarialääkkeenä käytetty kiniini, näyttäisivät olevan aktiivisia ja tuhoavan borreliabakteereja.

Jallerin blogiteksti, jota yllä referoin, löytyy täältä.

maanantai 15. kesäkuuta 2015

Suomessa yleisesti käytettävistä borrelioositesteistä ja niiden luotettavuudesta

Yleisin käytössä oleva borrelioosin tutkimusmetodi on kaksivaiheinen ELISA + western blot -tutkimus. Siinä ei jäljitetä itse taudinaiheuttajaa, vaan immuunijärjestelmästä etsitään borrelia burgdorferi -bakteeria vastaan syntyviä vasta-aineita. ELISA-testi mittaa vasta-aineiden kokonaismäärää ja Western blotit identifioivat yksittäisiä vasta-aineita sekä etsivät borrelialle uniikkeja proteiinimuodostelmia. ELISA-testi on borrelioosin seulontatesti, joka tehdään yleensä aina ensimmäisenä, ja mikäli seulonnassa löytyy asetetut viitearvot ylittäviä määriä vasta-aineita, niin tulokset varmennetaan ja eritellään tarkemmin jatkotestillä (western blot eli niin sanottu immunoblottaus).

Näiden kahden testin kuvaukset Huslabin sivuilla:

Seulontatesti (ELISA):
borrelia burgdorferi , vasta-aineet seerumista (S-BorrAb)
http://huslab.fi/ohjekirja/3552.html

Jatkotesti (western blot):
borrelia burgdorferi, vasta-aineet jatkotutkimus (S-BorAbJt)
http://huslab.fi/ohjekirja/8529.html

Muita mahdollisia, julkisella puolella käytössä olevia borrelioosiin testaustapoja ovat borreliabakteerin vasta-aineiden jäljittäminen selkäydinnesteestä sekä borreliabakteerin dna:n jäljittäminen selkäydin- tai nivelnesteestä otetusta PCR-näytteestä:

borrelia burgdorferi, vasta-aineet selkäydinnesteestä (Li-BorrAb)
http://huslab.fi/ohjekirja/3975.html

borrelia burgdorferi, nukleiinihapon osoitus (-BorrNhO)
http://huslab.fi/ohjekirja/4202.html

///

Vasta-ainetesteistä ja niiden luotettavuudesta:

Vasta-ainetestit perustuvat siis elimistön borrelia burgdorferi -bakteeria vastaan suuntaamien immuuniresponssien jäljittämiseen. Immuunisysteemi tuottaa itselleen vierasta tunkeilijaa eli antigeenia vastaan kahdenlaisia vasta-aineita, joista toinen on nimeltään immunoglobuliini M (IgM) ja toinen immunoglobuliini G (IgG). Näistä tarkemmin seuraavassa.

IgM:

Ensimmäinen immuunijärjestelmän sille vierasta tunkeilijaa vastaan tuottama vasta-aine on immunoglobuliini M. IgM:n kehittyminen testeissä mitattavissa olevalle tasolle vie 2-4 viikkoa. Sen määrä on huipussaan noin neljä viikkoa antigeenille altistumisen jälkeen. IgM-vasta-aine säilyy verenkierrossa yleensä noin 6 kuukautta, minkä jälkeen sen tasot hiipuvat mittaamattomiksi. Jos infektio ei parane, vaan jatkaa jylläämistään elimistössä, niin myös IgM jää koholle. Yleisesti ottaen borrelioosia sairastava potilas, jolla IgM on jatkuvasti koholla, sairastaa kroonista borrelioosia; toisaalta, IgM-arvon negatiivisuus ei kuitenkaan ole luotettava paranemisen indikaattori.

Jos vastasyntyneen vauvan IgM on koholla, kertoo se siitä, että vauva on saanut borrelioositartunnan. Kuitenkin, jos sikiö on altistunut borreliabakteerille jo aivan raskauden alkuvaiheessa, niin silloin IgM-vasta-ainetuotanto borreliaa vastaan ei tule ehkä koskaan käynnistymään, koska vauvan immuunisysteemi ei tunnista bakteeria vieraana tunkeutujana.

IgG:

Immunoglobuliini G muodostuu IgM:n jälkeen, noin 4-8 viikon kuluessa borreliabakteerille altistumisesta. Se katoaa ja muuttuu mittaamattomaksi alle 12 kuukaudessa tartunnasta. Huipussaan sen määrä on noin kuuden viikon kohdalla. Tämä vasta-aine kykenee läpäisemään istukan, joten borreliatartunnan saanut äiti voi siirtää vasta-aineen lapseen. Se, että lapselta löytyy positiivinen IgG-vasta-ainetitteri, ei automaattisesti merkitse aktiivista borreliainfektiota. Se merkitsee sitä, että äiti on altistunut bakteerille ja että lasta tulee tarkkailla huolellisesti mahdollisten oireiden varalta, jotta hoito päästään tarvittaessa aloittamaan ajoissa.

--> Koska vasta-aineita on olemassa näitä kahta eri tyyppiä, niin tästä syystä myös borrelioosia tutkivat vasta-ainetestit sisältävät kukin kaksi testiä:

ELISA-testillä voidaan tutkia IgM- tai IgG-vasta-aineita tai molempia niistä. Samoin western blotissa tutkitaan IgM- tai IgG-vasta-aineet tai molemmat.


ELISA:

ELISA-testi (Enzyme-linked immunosorbent serum assay) jäljittää vasta-aineita, joita elimistömme tuottaa altistuessaan borrelia burgdorferi -bakteerille. Tämä testi on automatisoitu, hinnaltaan edullinen ja siksi suosittu. Testin luotettavuutta on tutkittu useissa tutkimuksissa ja osoitettu sen epäluotettavuus. Testin ongelmakohdista ja puutteista seuraavassa.

Borreliabakteerin polymorfismi eli monimuotoisuus on suuri haaste ELISA-testille. Potilaan elimistöön pesiytynyt bakteeri voi muuttaa muotoaan useisiin eri muotoihin ja erota testissä käytetystä borrelia-antigeenistä sen verran, että testin tulos on negatiivinen siitä huolimatta, että vasta-aineita elimistössä kuitenkin on. Se fakta, että esimerkiksi Euroopassa esiintyy useampaa borreliabakteerin alalajia, mutkistaa tilannetta entisestään. Ongelma syntyy siinä kohtaa, kun sen sijaan, että antigeeninä käytettäisiin "villiä" borreliabakteerikantaa, käytetäänkin laboratoriossa kasvatettua kantaa. Lähes kaikki laboratoriot käyttävät borrelia burgdorferin B31-lajia ja siis laboratoriossa kasvatettua versiota siitä. Testissä käytetään B31:sta puhdistettuja antigeeneja ja ne ruiskutetaan hiiriin, jolloin tulee mahdolliseksi eristää monoklonaalinen vasta-aine suhteessa jokaiseen antigeeniin. B31 kasvaa hyvin viljelmässä ja siksi se on edullinen ja jatkuva tapa tuottaa borreliabakteeria testin käyttöön. Hiiren monoklonaalinen vasta-aine kuitenkin eroaa ihmisen samaa antigeenia vastaan tuottamasta vasta-aineesta. Näin ollen tilanne on samankaltainen kuin jos vertaisi omenoita appelsiineihin. ELISA-testin luotettavuuden testaamiseksi on tehty koe, jossa käytettiin ihmisen seerumia testaamaan 516 eri ELISA-testin luotettavuutta. Testin osuvuus oli vain 45 %.   

ELISA-testin spesifisyys on johtanut siihen, että muut borrelian lajit kuin tämä käytetty B31 jäävät testeissä havaitsematta. Lisäksi on niin, että ELISA kykenee jäljittämään vain vapaat vasta-aineet. Se ei havaitse vasta-aineita, jotka ovat sitoutuneet antigeeniin. ELISA-testin toiminta on riippuvainen siitä, että aktiiviset, vapaat vasta-aineet kiinnittyvät vapaisiin, koeputkessa synnytettyihin antigeeneihin. Jos testattavassa seerumissa olevat vasta-aineet ovatkin jo kiinnittyneet antigeeneihin, niin entsyymireaktiota ei voi tapahtua. Tätä tapahtumaa kuvaa hyvin avain ja lukko -metafora: vasta-aine on avain, joka sopii lukkoon (antigeeni). Bakteerin pinnalla on antigeenejä eli lukkoja. Kun avain eli vasta-aine on jo lukossa (sitoutunut antigeeniin), ei avain voi avata enää muita lukkoja.

ELISA-testeissä on myös tulkintaongelmia. Lääkärit ottavat testissä löydetyt korkeat vasta-ainetasot yleensä indikaationa siitä, että potilas on todella sairas. Kuitenkin asia on päin vastoin. Jos potilas on suuren bakteerilastin infektoima, niin hänellä on verenkierrossa kiertämässä runsaasti vapaiden vasta-aineiden kanssa sitoutuneita bakteeriantigeeneja, jotka eivät siis näy testissä. Vapaan antigeenin lisääntyessä vapaat vasta-aineet vähenevät. Näin ollen negatiivinen tulos ELISA-testissä voikin itse asiassa merkitä hyvin vakavaa infektiota.

Tilannetta voi verrata rokotuksissa esiintyvään tilanteeseen. Jos ihminen rokotetaan vaikkapa jäykkäkouristusta vastaan, niin hänellä esiintyy testattaessa korkea vapaiden vasta-aineiden titteri. Jos vasta-aineita yritetään mitata tunti rokotuksen jälkeen, niin testitulos on negatiivinen. Näin on siksi, että injektoitu jäykkäkouristusantigeeni kompleksoi kaikki saatavilla olevat vapaat vasta-aineet ennen kuin keho voi tuottaa niitä lisää, jolloin mitattavissa oleva vapaa vasta-ainetaso tippuu. Kun antigeenien määrä lisääntyy eli bakteerien jakautuminen kiihtyy, vapaa vasta-ainetaso laskee.

Korkea vasta-ainetaso ELISA-testissä indikoikin siis potilaan immuniteetin tasoa. Korkea vasta-ainetitteri kertoo siitä, että potilaalla on korkea luonnollinen immuniteetti. Matala vasta-ainetitteri vastaavasti kertoo siitä, että infektio jyllää elimistössä.


Western blot: 

Tämä testi tekee "kartan" niistä vasta-aineista, joita immuunisysteemi tuottaa reaktiona havaitsemaansa bakteeriin eli antigeeniin. Kartta erottelee vasta-aineet suhteessa niiden antigeenien painoon (raportointiyksikkönä kilodalton kDa). Jokainen testissä havaittu vasta-aineen ja antigeenin välille muodostuva juoste edustaa vasta-ainereaktiota suhteessa tiettyyn borreliabakteerin spirokeetasta löytyvään proteiiniin. Se, mitkä juosteet katsotaan borrelialle diagnostisiksi, on täysin mielivaltainen päätös ja sopimiskysymys. Alun perin western blot -testi oli laaja-alaisempi ja useampia juosteita tulkittiin borrelialle diagnostisiksi, mutta sitten yhtäkkiä testiä ja sen tulkintaa pohtineessa komiteassa vain päätettiin, että eräät hyvin keskeiset proteiinit ja niitä vastaavat juosteet (proteiinit, joita oli käytetty borreliarokotteen kehittelyssä) jätetäänkin testin ja analyysin ulkopuolelle. Tämä päätös synnytti runsaasti kritiikkiä ja huolta testin luotettavuuden heikkenemisestä, minkä seurauksena, välttyäkseen kritiikiltä jatkossa, osa laboratorioista päätti ryhtyä raportoimaan testin tulokset vain "negatiivisena" tai "positiivisena"

Tähän testin ja sen tulkinnan muutokseen liittyen tehtiin tutkimus, jossa tutkittiin sitä, mikä määrä borrelioosidiagnooseja syntyy näillä uusilla kriteereillä verrattuna vanhoilla kriteereillä syntyneisiin diagnooseihin. Tutkimukseen osallistui 66 lasta, joilla oli todistetusti ollut punkkikontakti ja sen seurauksena rengasihottuma (EM) ja siten varma borrelioositartunta. Kun heitä tutkittiin vanhalla versiolla western blotista, niin he kaikki saivat diagnoosin. Uutta testiä käyttäen lapsista vain 20 sai diagnoosin. 46 jäi ilman diagnoosia ja tosielämässähän tämä tilanne tarkoittaisi sitä, että nämä 46 varmaa borrelioosipotilasta jäisivät myös ilman hoitoa.  

Lähde: http://www.lymeneteurope.org/info/laboratory-tests

ELISA- ja western blot -testien erosta kiinnostuneille hyvä, asiaa selventävä linkki:
http://www.ticktalkireland.org/elisavswb.html

Lymen tautia sairastavia potilaita hoitava lääkäri Daniel A. Jaller kirjoittaa blogissaan kriittisesti näistä kahdesta vasta-ainetestistä. Hän huomauttaa, että ELISA-testin oli alkuun tarkoitus olla seulontatesti, jossa ristiinreagointimahdollisuuden takia tulee paljon vääriä positiivisia tuloksia. Testin tarkoitus oli olla sensitiivinen, mutta ei borrelia-spesifi. Jatkotestin tarkoitus oli sitten varmistaa, että ELISAssa saadut tulokset todellakin ovat positiivisia. Testejä luotaessa oletettiin, että borrelioosi on harvinainen sairaus. Kuitenkin kun kontrolliryhmässäkin saatiin paljon positiivisia tuloksia, niin ajateltiin, että kyseessä on ristiinreagoinnista johtuva positiivinen tulos. Tämän seurauksena borrelioosin diagnostiset kriteerit asetettiin niin korkealle, että seurauksena olikin se, että tuloksina alettiin saada paljon vääriä negatiivisia vastauksia. Se, että western blotissa saadaan ELISA-testissä negatiivisilta potilailta positiivisia tuloksia, todistaa sen, että asia on juurikin näin. Jallerin mielestä ELISA-testiä olisi syytä kehittää sellaiseksi, että siinä testattaisiin vain borrelialle spesifejä vasta-ainereaktioita, ja tällöin jo yksikin löytynyt reaktio olisi borrelialle diagnostinen.
(Jallerin blogikirjoitukset:
http://lymemd.blogspot.fi/2008/05/my-blood-test-says-i-dont-have-lyme.html
http://lymemd.blogspot.fi/2008/07/lyme-antibodies-revisited.html)

Myös Joseph J. Burrascano huomauttaa, että ajatus kaksivaiheisesta testaamisesta, jossa käytetään ensin ELISA-testejä, minkä jälkeen tehdään, jos tulokset ovat positiivisia, tulokset vahvistava immunoblottaus, on epälooginen tämän sairauden kohdalla, sillä ELISA ei ole tarpeeksi sensiviitinen toimiakseen seulontatyökaluna. Monilla borrelioosipotilailla ELISA-tulos on negatiivinen, diagnostisten western blotien esiintyessä.
(Burrascanon teksti: http://www.lymenet.org/BurrGuide200810.pdf
Suomenkielinen referaatti Burrascanosta löytyy viisiosaisena kirjoitussarjana tämän blogin helmikuun 2015 teksteistä.)

Kaksivaiheisen vasta-ainetestauksen ongelmista syvemmin kiinnostuneille linkkejä aihetta käsitteleviin tieteellisiin artikkeleihin:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2078675/
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21271270
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15770021
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1195970/
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8989928


Borreliavasta-aineet selkäydinnesteestä:

Esimerkiksi Burrascano ei rutiininomaisesti suosittele selkäydinpunktiota, koska negatiivinen tulos siinä ei poissulje Lymen borrelioosia. Vasta-aineita borrelia burgdorferille tavataan enimmäkseen Lymen meningiitissä ja niitä löydetään harvoin ei-meningiittisessä keskushermoston infektiossa. Jopa meningiittitapauksissa vasta-aineita tavataan vain alle 13%:lla kroonisista borrelioosipotilaista. Selkäydinpunktio on Burrascanon mielestä suositeltava vain, jos potilaalla on etiologialtaan epäselviä neurologisia tautimanifestaatioita ja jos potilas on seronegatiivinen, tai jos oireita on vielä hoidon jälkeenkin. Tarkoituksena on poissulkea muut taudin aiheuttajat sekä etsiä Lymeen sopivia ominaisuuksia selkäydinnesteestä. Tärkeää on etsiä kohonneita proteiini- ja valkosolutasoja, koska niiden läsnäolo indikoi tarvetta aggressiivisemmalle hoidolle. Samoin likvornesteen paine voi Lymessa olla kohonnut.  



PCR-testi:

Richard I. Horowitz kirjoittaa kirjassaan Why Can't I Get Better, että polymeraasiketjureaktio (PCR), joka on DNA-testi, on tärkeä potilaille, joilla vasta-ainetestit ovat negatiiviset. On kuitenkin mahdollista, että positiivisen tuloksen saamiseksi vaaditaan useita eri testikertoja käyttäen erilaisia tutkimusmateriaaleja (kuten seerumia, nivelnestettä, virtsaa tai likvornestettä). Käytettävän laboratorion tulee olla luotettava ja aiheeseen hyvin perehtynyt. Sensitiivisyys on 30%:n luokkaa, spesifisyyden ollessa yli 99% (eli testi on hyvin tautispesifi ja antaa vain vähän vääriä positiivisia tuloksia).

///

Keskustelu näiden laboratoriotestien luotettavuudesta ja niiden merkityksestä Lymen taudin diagnosoinnissa on Lymen tautia hoitavien kahden eri koulukunnan, IDSA:n ja ILADS:n, välisen kiistan keskiössä. Lyme-potilaita hoitava lääkäri Richard I. Horowitz käy kirjansa Why Can't I Get Better? Solving the Mystery of Lyme and Chronic Disease toisessa luvussa läpi näiden kahden eri koulukunnan näkemyksiä Lymen taudin diagnosoimisesta. Olen referoinut Horowitzin ajatuksia täällä.

perjantai 5. kesäkuuta 2015

Western blotin tulokset

Kun western blotin (linkki Tyks:n laboratorion sivuilla olevaan testin kuvaustekstiin) tuloksia ei alkanut yli kolmen viikon odotuksen jälkeen kuulua, niin soitin sairaalaan ja kysyin ne puhelimitse. Hoitaja kertoi sekä IgM:n että IgG:n olevan negatiiviset. Kysyin, että eikö tuloksia ole eritelty mitenkään tarkemmin, mihin hoitaja vastasi, että ei ole. Huomasi sitten kuitenkin vielä, että C6-indeksin arvo on 0.23. Kuulosti siltä, että hoitajalla oli ensimmäistä kertaa ikinä edessään western blotin tulokset eikä niiden tulkinta ollut tuttua. Kiitin saamistani tiedoista ja esitin toiveen saada laboratoriotulokset lausuntoineen paperilla kotiosoitteeseeni.

Ryhdyin sitten itse kaivelemaan tarkempaa tietoa siitä, mitä western blotilla oikeastaan tutkitaankaan sekä mitä tuo C6-indeksi tarkoittaa. Jos nyt olen ymmärtänyt asian oikein, niin western blotilla tutkitaan, erona ELISA-seulontatutkimukseen, nimenomaan borreliabakteerille spesifejä antigeenejä. Tällöin mikä tahansa western blotissa havaittu reaktio suhteessa käytettyihin antigeeneihin kertoo siitä, että kyseessä on reaktio nimenomaan borreliabakteeriin.  C6-indeksi taas lasketaan silloin, kun western blotissa havaitaan reaktiivinen näyte.

Mikä tämä C6-indeksi on ja miten sitä pitäisi tulkita? Lääkäri Daniel A Jaller kirjoittaa asiasta blogissaan:

"This brings us to the C6 peptide test. This is an ELISA test which correlates with specific reactivity of a very, very specific outer surface protein on the Lyme bacteria. There are virtually no false positives here. The cutoff has been set so high that the test is worthless based on the standards set by the manufacturer. It is interesting that Gary Wormser, the chief critic of chronic Lyme is financially connected to Immunetics, the company which developed this test. There is no reason for any non zero value other than exposure of the immune system to the spirochetes which cause Lyme disease. In fact C6 peptide indices of 0.2 to 0.3 are typically seen in patients who have positive Western Blots even by CDC surveillance criteria. Patients who are treated for Lyme frequently sero-convert. They develop a greater antibody response after antibiotic therapy. By the same token, the C6 peptide index frequently doubles after the patient receives therapy with antibiotics. The standard of a C6 index of greater than 0.9 is ridiculous in my experience. Any level greater that zero is suggestive. Values greater that 0.3 are reliable in confirming the diagnosis." 

Sama asia lyhyesti suomeksi: C6-peptiditestissä ei ole vääriä positiivisia tuloksia. Jos laskettu indeksi on arvoltaan suurempi kuin nolla, tarkoittaa tämä sitä, että immuunisysteemin on altistunut Lymen tautia aiheuttaville spirokeetoille. On tyypillistä, että C6-indeksiä arvoilla 0.2-0.3 tavataan potilailla, joilla on positiivinen western blot jopa CDC:n tiukoilla diagnostisilla kriteereillä arvioituna. Se, että C6-indeksi on diagnostinen vasta isommilla arvoilla kuin 0.9 on Jallerin mielestä naurettavaa. Jokainen nollan ylittävä arvo viittaa borrelian suuntaan ja arvot, jotka ovat suurempia kuin 0.3, ovat Jallerin mielestä diagnostisia.

Vaikka minun western blotini tulokset siis ilmoitettiin minulle negatiivisina, niin mitä ilmeisimmin testeissä on havaittu vasta-ainetoimintaa suhteessa yhteen tai useampaan borrelia-antigeeniin, mikä taas esimerkiksi lääkäri Daniel A Jallerin mukaan on vahva merkki borreliasta. Myös saksalaisten lymfosyyttitestien tulokset viittaavat vahvasti borreliaan. Sairastumiseni alkuvaiheessa otetut suomalaiset seulontatestit (ELISA vasta-aineet) olivat nekin "negatiiviset". mutta todellisuudessa vasta-aineet, etenkin IgG-vasta-aineet, olivat viitteen yläosassa. Kliininen taudinkuvani sopii lääkäreidenkin mielestä täydellisesti borrelioosiin. Vedän tästä itse omat johtopäätökseni.